大动物多基因编辑sgRNA表达策略的优化

Optimization of sgRNA expression strategy to generate multiplex gene-edited pigs

摘要: CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术在大动物的多基因修饰改良中展示出巨大的应用前景。然而，由于大多数研究基于人类和小鼠模型，不同的sgRNA表达策略是否会影响大动物的多基因编辑效率仍然悬而未决。根据之前研究，sgRNA的表达策略主要有三种：携带不同sgRNA的质粒的共转染的策略，转染单个含有串联sgRNA表达盒质粒的策略，以及转染表达多顺反子sgRNA表达载体的策略（PTG策略）。该研究以猪的CD163和MSTN为靶点，评估这三种策略介导的多基因编辑效率。结果表明，这些策略在不同的物种中展示出差异的基因编辑能力，尽管PTG策略在植物和人类细胞系中显示出较高的基因编辑效率，该策略在猪胎儿成纤维细胞（PFF）中效率较低。在这三种策略中，串联sgRNA表达盒的策略显示出最大的编辑效率。通过这种方法，我们获得了CD163和MSTN双基因编辑的PFF系。体细胞核移植结果表明，这种方法足以高效生产纯合子多基因（CD163和MSTN）编辑猪。全基因组测序结果表明，这种策略具有高效率编辑和低脱靶的优势。该研究为大动物的多基因编辑提供了一种安全有效的sgRNA表达策略，为培育抗猪繁殖和呼吸障碍综合征（PRRSV）和高生产率猪育种奠定了基础。